En el flujo de proceso para extracción de RNA, que incluye: recolección, estabilización, aislamiento y almacenamiento. Puedes tomar precauciones para superar problemas como la inestabilidad del ARN, la posible contaminación y la degradación, ya que esta es una molécula muy lábil y susceptible.
A continuación, te compartimos algunos aspectos clave que te llevarán a una extracción de RNA exitosa.
Recolección y estabilización:
Inmediatamente después de la recolección de la muestra de sangre, células, tejidos, bacterias etc, procura mantenerla en nitrógeno líquido o congelación de −80 o −20°C o usa una solución estabilizadora para proteger la integridad del RNA como estas:
Durante la extracción:
¡Mucho cuidado con las RNAasas!
Las ribonucleasas (RNasas) son enzimas muy estables y activas que generalmente no requieren cofactores para funcionar. Dado que las RNasas son difíciles de inactivar e incluso cantidades mínimas son suficientes para destruir el ARN, nunca utilices artículos de plástico o vidrio sin eliminar primero la posible contaminación por RNasas.
Debes tener mucho cuidado para evitar introducir inadvertidamente RNasas en la muestra de ARN durante o después del procedimiento de purificación. Para crear y mantener un entorno libre de ARNasa, te recomendamos tomar las siguientes precauciones durante el pretratamiento y el uso de tubos y soluciones desechables y no desechables mientras se trabaja con ARN:
Utiliza una técnica microbiológica y aséptica adecuada cuando se trabaja con ARN. Las manos y las partículas de polvo pueden transportar bacterias y moho, que son las fuentes más comunes de contaminación por RNasas.
Usa siempre guantes de látex desechables al manipular reactivos y muestras de ARN para evitar la contaminación por ARNasas de la superficie de la piel o del equipo de laboratorio polvoriento, y cámbialos con frecuencia.
Elementos de plástico:
Mantén los tubos cerrados siempre que sea posible.Usa tubos de polipropileno desechable, de un solo uso y estériles durante todo el procedimiento. Estos tubos generalmente no contienen RNasas y no requieren tratamiento previo para inactivar las Rnasas.
Elementos de vidrio:
Si vas a usar material de vidrio, este debe tratarse antes de su uso para garantizar que esté libre de RNasa:
El material de vidrio utilizado para el trabajo con ARN debe limpiarse con un detergente, enjuagarse minuciosamente y hornearse en un horno a 240 °C durante al menos 4 horas (durante la noche, si es más conveniente) antes de su uso. La esterilización en autoclave por sí sola no inactivará completamente las RNasas.
Alternativamente, este material se puede tratar con DEPC (pirocarbonato de dietilo): Llena el recipiente de vidrio con 0,1 % de DEPC* (0,1 % en agua), déjelo reposar durante la noche (12 horas) a 37 °C y luego esteriliza en autoclave o caliente a 100 °C durante 15 minutos para eliminar el DEPC residual.
Cámaras de electroforesis:
Las cámaras de electroforesis deben limpiarse con una solución de detergente (p. ej., SDS* al 0,5 %), enjuagarse minuciosamente con agua libre de ARNasa y luego enjuagarse con etanol y dejar secar.
Los plásticos utilizados para algunos tanques de electroforesis no son resistentes al etanol. Tenga el cuidado adecuado y verifique la información del proveedor.
Soluciones:
Las soluciones (agua y otras soluciones) deben tratarse con DEPC al 0,1 %.DEPC es un inhibidor fuerte, pero no absoluto, de las RNasas. Se usa comúnmente en una concentración del 0,1 % para inactivar las RNasas en vidrio o artículos de plástico o para crear soluciones y agua sin RNasas. DEPC inactiva las RNasas mediante modificación covalente. Agrega 0,1 ml de DEPC a 100 ml de la solución a tratar y agite vigorosamente para que el DEPC se disuelva. Deja incubar la solución durante 12 horas a 37°C. Esteriliza en autoclave durante 15 minutos para eliminar cualquier rastro de DEPC. DEPC reaccionará con aminas primarias y no se puede usar directamente para tratar tampones Tris porque es muy inestable en presencia de tampones Tris y se descompone rápidamente en etanol y CO.2. Entonces al preparar tampones Tris, primero trata el agua con DEPC y luego disuelva Tris para obtener el tampón adecuado. Pequeñas cantidades de DEPC modificarán los residuos de purina en el ARN mediante carbetoxilación. El ARN carbetoxilado se traduce con muy baja eficiencia en sistemas libres de células. Sin embargo, su capacidad para formar híbridos de ADN:ARN o ARN:ARN no se ve seriamente afectada a menos que se haya modificado una gran fracción de los residuos de purina.
El DEPC residual siempre debe eliminarse de las soluciones o recipientes mediante autoclave o calentamiento a 100 °C durante 15 minutos.
Y por supuesto, usa un kit de extracción que te permita obtener RNA de la mejor concentración y calidad, aquí te damos algunas opciones:
Almacenamiento:
Inmediatamente después de obtener tu RNA extraído prepara alícuotas para las aplicaciones posteriores como cuantificación, electroforesis, qPCR, dPCR y/o NGS, pues descongelamiento y congelamiento provoca degradación.
Almacena tus alícuotas de –15°C a –30°C ó –65°C a –90°C, así estarán estables hasta por 1 año sin degradación.
Aplicaciones posteriores:
Mantén el ARN purificado en hielo cuando se pipeteen alícuotas para aplicaciones posteriores.
Y si estás listo para llevar tu extracción de RNA a otro nivel, automatízate:
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