La fase preanalítica es el periodo más crítico en la evaluación de PD-L1, ya que representa el origen de hasta el 70% de los errores diagnósticos o falsos negativos en el laboratorio de patología. A diferencia de las tinciones histológicas convencionales, la proteína PD-L1 es altamente lábil y susceptible a la degradación si el tejido no se maneja bajo estrictos estándares de tiempo y temperatura.
Este kit es un ensayo inmunohistoquímico cualitativo que utiliza el anticuerpo monoclonal unido anti pdl1-22c3.
Fijación:
Isquemia fría: Es el tiempo que transcurre entre la extracción del tejido corporal y la inmersión en el fijador. Este tiempo debe ser lo más corto posible, menos de una hora, ya que influye mucho en los resultados de la inmunohistoquímica. Para la fijación, las muestras deben sumergirse en una solución de Formol Tamponado neutro al 10% y transportarse en condiciones controladas de temperatura para evitar que se calienten.
La isquemia fría altera la intensidad de la tinción de las células MDA MB-453 (línea celular 2+). Se observa una inmunorreactividad de membrana débil a moderada en aproximadamente la mitad de las células en un pellet celular fijado inmediatamente en NBF al 10% (0 horas). Con tan solo una hora de isquemia fría (el sedimento celular se mantuvo húmedo bajo una gasa humedecida con solución salina), la morfología ya se deteriora y se observa un aumento en el número de células con tinción de membrana. Tras dos horas, la tinción es aún más intensa; después de cuatro horas de isquemia fría, gran parte de la tinción de membrana se pierde y la conservación de las células es deficiente. Esto ilustra la necesidad de una fijación rápida y que diferentes tiempos de isquemia fría pueden provocar una tinción excesiva o insuficiente de las membranas celulares.
Tiempo de fijación: Debe ser de entre 12 y 72 horas, un tiempo de fijación más corto o extenso afectará los resultados de inmunohistoquímica.
La proporción entre el fijador y la muestra debe ser entre 15:1 o 20:1.
Procesamiento de tejidos: El Laboratorio debe implementar procedimientos operativos en los que se describan y garanticen la rotación y el cambio de los reactivos en el procesador de tejidos.
Utilice reactivos de alta calidad y que se encuentren certificados.
La temperatura de la parafina: En la central de inclusión debe ser de 2 a 3°C por encima del punto de fusión de la parafina y debe monitorearse a diario.
Utilice una central de inclusión que garantice un entorno regulado y que permita controlar y ajustar la temperatura de la parafina.
La temperatura del depósito de la parafina debe ser inferior a 60°C.
Use parafina apta para histología.
La temperatura de la parafina debe ser inferior a 60°C para evitar daños en los epítopos, lo que podría causar variabilidad en la detección de PDL-1.
Microtomía:
Implante un procedimiento de mantenimiento de los micrótomos que garantice portaobjetos de alta calidad para el diagnóstico.
Cuchilla desechable: Debe estar afilada y libre de defectos.
Antes de cortar los tejidos, debe solicitar los anticuerpos correspondientes a cada lámina en el software del instrumento Dako Link y etiquetar cada lámina.
Corte las muestras del tejido en secciones de 4 a 5 micras.
Si corta secciones de menos de 4 micras esto puede acarrear variabilidad en la detección del PDL-1.
Baño de flotación: debe contener únicamente agua destilada y ajustarse de 46 a 48°C.
Montaje: Los cortes deben pescarse en láminas portaobjetos cargadas destinadas para este fin. (DAKO FLEX IHQ o Fisher Brand Superfrost Plus IHQ.
Controles de calidad: Deben incluirse en cada lote de tinción para evaluar la calidad de la tinción.
Portaobjetos con línea celular de control: Teñidos con el Ac Prtimario PDL-1 Pharma DX. (Incluidos en el Kit).
Tejidos de control interno positivo y negativo: Teñidos con el Ac primario PDL-1. Ya sea en otro o en el portaobjetos con la muestra del paciente. O en el portaobjetos con la muestra del paciente.
Tejido de amígdala: Como control opcional nos mostrará diferentes grados de tinción para inmunohistoquímica. Tinción positiva intensa, moderada o débil y tinción negativa.
Horno: Introduzca los portaobjetos en un horno a 58 más o menos 2°C por una hora.
Calentar los portaobjetos a una temperatura más alta o exponer las láminas por más tiempo en el horno puede dañar los epítopos.
Recomendación: Llevar las láminas en posición vertical garantiza que el agua y la parafina se eliminen por completo.
Conserve todos los componentes del Kit PDL-1 y los portaobjetos de Control en un lugar oscuro y de 2 a 8°C.
Solución recuperadora antigénica: Utilice agua destilada o desionizada o agua de calidad reactivo, tome 1,5 litros y llévela al interior del PT LINK en uno de sus dos contenedores, Tome un frasco de PH Bajo Envision Flex en proporción 1:50 y dilúyalo en el agua destilada hasta completar el nivel requerido. Deseche la solución después de 3 días de uso o 5 días después de la dilución.
Tampón de lavado: Diluya la solución Tampoón de Lavado Envision Flex en agua destilada, desionizada o calidad reactivo: Proporción 1:20 Mezcle: 9,5 litros de agua y 500 ml de solución de tampón concentrado.
Llene una estación de lavado con 1,5 litros de la solución de trabajo.
Llene una botella de lavado.
Conservación: De 2 A 8°C como máximo por un mes.
Nota: Descártelo si la solución se observa turbia.
Diaminobencidina solución de trabajo: Añada 1 gota de Cromógeno por 1 ml de tampón sol de sustrato y mezcle.
Si se prepara directamente en la botella, añada 9 gotas de cromógeno de dab mezcle bien. Sí, si se observa precipitado durante la preparación, esto no afectará los resultados.
Estabilidad: 5 días en lugar oscuro de 2 a 8°C.
Resumen: Utilice los métodos estándar para la conservación de las muestras: Fijadas en formol tamponado e incluidas en parafina a 4 micras y en portaobjetos cargados.
